昨天和师兄一起去港大的Genome Research Center了解了一下关于454测序的情况，那边的老师很耐心地给我们作了相关介绍。今天把了解到的内容简单整理一下：
1. 454测序原理
简单说就是把DNA样品中的每条DNA连到一个小球上，然后通过一系列的反应和操作，可以得到从小球开始的大约400个bp的序列。一个454测序反应理论上可以得到100万条序列，考虑到效率的问题，实际得到的序列可能略少一些。
具体说来非常复杂，就不说了。
2. 454测序可以用来干什么？
主要有两方面的作用：（1）基因组测序，先把基因组DNA打断，然后进行454测序，结果中很多序列就会有重叠的部分，这样就可以进行拼接，从而得到完整的基因组；（2）微生物群落结构分析，先以环境样品的DNA为模板用通用引物做PCR，再进行454测序，然后就可以分析微生物的多样性和丰度，就和建克隆文库类似，只是数据量大很多。
3. 多个环境样品（比如土壤）要分析微生物群落结构，可以一次（一个反应）搞定吗？
可以。原理是这样的：在PCR的时候将Primer的5′端加上几个碱基（称为barcode），每个样品用的Primer的barcode不一样，因为这种测序是可以测出Primer序列的，所以得到序列之后，就可以根据Primer判定序列是来自哪个样品。如果有10个样品，在PCR的primer就要设计10种barcode，这样理论上每个样品最后就可以得到10万条序列。
4. 454测序价格
目前进行一次454测序，价格可能要10万人民币以上，如果样品比较特别或有其它特殊要求，价格可能还要高，港大的Genome Research Center对校内的收费价格有不少优惠。因为454测序可以一次同时很多样品，这样就可以把不同单位的样品拼在一起，降低成本，据说可以降到3万甚至更低。高通量测序价格
5. 454测序的优点
很明显，数据量超大，可以了解很多细小微妙的信息。
6. 454测序的局限性
（1）序列片段较短，只能达到400个bp左右；
（2）克隆建库，可以拿到质粒，长期保持，454测序得不到质粒；
（3）价格太高。
更多关于454测序的信息请看：http://www.454.com/
RDP开发的专门用于454测序结果处理的工具：http://pyro.cme.msu.edu/
十月 27th, 2010 at 15:39
你好，不知道博主是哪里人，我是华中农业大学的学生。我想做一个柿子果实的转录组测序，可是不知道454能不能做六倍体的，希望博主能解答一下！还有就是能不能拿到港大去做啊？我的邮箱是yfysir@gmail.com.万望回复!
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Ye Lin Reply:
十月 27th, 2010 at 20:13
我们做的是微生物方面的，对植物的不太了解啊！
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一月 13th, 2011 at 17:06
YL，问你几个问题：
1. “454序列片段较短，只能达到400个bp左右”那怎样能拿到全长序列？可不可以向shortgun sequencing那样进行拼接，然后拿到全长呢？
2. 如果是能拼接，要测多少条序列才能相当于做一次clong library，比如挑96个clones。
3. 454 sequencing要很贵么？做一个environmental sample的多样性分析最少也要3万？
谢谢！
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Ye Lin Reply:
一月 13th, 2011 at 20:03
师兄，是这样的：
1. 目前这些高通量测序都不能拿到16S全长的序列。一般都是测16S上的V3区或V4区或V6区这些可变区。
2. 16S扩增后高通量测序现在都不做拼接。
3. 我听说，内地那边有的公司，做一个样品的话，几千块钱就可以了，但是加上数据分析的费用，应该也要过万。我们现在就是测了以后自己分析数据。
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Davvy Reply:
一月 13th, 2011 at 20:14
自己做数据分析？太酷了！就是用RDP哪个pyrosequecing pipeline？以后要多向你讨教！正愁用什么新方法来分析我的sample呢。
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Ye Lin Reply:
一月 13th, 2011 at 23:30
那个只是其中一个工具，也要用一些其它工具，还要根据情况自己写一些程序。
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五月 8th, 2011 at 15:22
i guess i should be your roommate in hku,ha, which room u can guess,ha
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叶林 Reply:
五月 8th, 2011 at 20:24
我知道你是谁了：）
呵呵
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五月 8th, 2011 at 21:09
住了挺长时间了，还不知道竟然是老乡，但是我当时猜你是北方人来着。
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五月 20th, 2011 at 15:48
在PCR的时候将Primer的3′端加上几个碱基（称为barcode）,这里有疑问，我认为应该是在5′端加上barcode
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叶林 Reply:
五月 20th, 2011 at 16:00
不好意思，写错了，是在5′端加barcode
多谢指正，已修改 ：）
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九月 13th, 2011 at 20:43
Really helpful！
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十月 18th, 2011 at 17:07
hello，你好，我想问下，barcode可不可以加到primer的中间呢？
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叶林 Reply:
十月 18th, 2011 at 17:27
加到primer中间，primer就不是primer了啊，就没法扩增了啊。
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十月 21st, 2011 at 14:26
PCR was conducted using forward primers GCCTCCCTCGCGCCATCAG-
(barcode)-TCCTACCCTTTGTGAATTTG and reverse primer GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-CTGCGTTCTTCATCGTTGCG. These primers are a modification of the previously described ITS-1 primers MN100 and MNGM2 (Edwards et al., 2008; Nicholson et al.,
2009), with the universal forward pyrosequencing adaptor, and one of 12 barcode sequences attached to the 5″ end of
the forward primer, and the universal reverse pyrosequencing adaptor added to the 3″end of reverse primers.这个摘自“Phylogenetic diversity and community structure of anaerobic gut fungi (phylum Neocallimastigomycota) in ruminant and non-ruminant herbivores”这个引物你可以给我解释一下吗？十分感谢！
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叶林 Reply:
十月 24th, 2011 at 11:11
解释什么呢？
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黄 Reply:
十月 24th, 2011 at 22:01
就是这个我感觉barcode 加到了引物中间，测序的adapter是在扩增前得引物上嘛？
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叶林 Reply:
十月 26th, 2011 at 00:03
不是，(barcode)一边是Adaptor，一边是引物。
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十月 30th, 2011 at 20:11
请问如果加上barcode的话，用454测对少个环境样品比较合适呢
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叶林 Reply:
十月 30th, 2011 at 20:29
这个不好说，取决于实验的目的、样品的复杂度，经费是否充裕等方面。
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十月 31st, 2011 at 11:57
我想去口腔黏膜微生物，比较两组患者微生物群组成的不同，用454测序的话，一共可以取60个人吗，每组保证30个？
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叶林 Reply:
十月 31st, 2011 at 14:06
口腔黏膜微生物的复杂程度我不清楚啊，你自己把握吧。
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十一月 1st, 2011 at 22:48
如果我选择分析16srRNA中的段片段，像v3这种，是不是就可以增加更多的样本量
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叶林 Reply:
十一月 2nd, 2011 at 09:17
分析哪一段与是否可以增加样本量没有关系吧。
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十一月 2nd, 2011 at 22:18
哦，明白了，谢谢，博主。
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十一月 14th, 2011 at 19:26
麻烦问下，adaptor是什么时候加上的，是在扩增前，还是扩增后测序公司加啊？
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叶林 Reply:
十一月 15th, 2011 at 10:14
有两种策略，可以扩增前加到Primer上，也可以扩增后再加。
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黄 Reply:
十一月 15th, 2011 at 20:20
如果有一百个样品，那用多少bp的barcode合适呢？
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十一月 18th, 2011 at 22:41
在麻烦你下，就是barcode的设计有什么原则？是不是越少越好？
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paulo Reply:
十二月 19th, 2011 at 16:25
我也不是很懂，随便说说。。
barcode并不是越少越好，设计时要考虑不同barcode之间的编辑距离（Levenshtein edit distance）是否足够大，这样即使测序返回结果的barcode有一两个碱基错误也能识别出来，另外barcode长度的话，要考虑测序仪能力、引物长度和要测序片段的长度范围，还有，如果adaptor，如果在送测序前自己PCR时就加上adaptor了，这时可以把barcode设计得稍长一些，即使扩增效率低也可以自己解决，但是如果送测序公司让公司加adaptor再测序的话，导致的测序量低或者不均匀等问题就会很头疼了。。通常6-10bp吧，不同的barcode在测序时会呈现一定程度的偏好性，这方面可以找找参考文献，Roche有推荐的barcode列表，可以从其中挑选自己认为合适的来设计实验
今天无意中看到了博主的有个博客，受益匪浅啊，膜拜～Orz～～
我也是做微生物群落16S 454测序方面的，不过是个小菜鸟，要多多关注博主的博客了～～
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