荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。非生物学专业的同学请不要往下看了。

1 载玻片涂层处理（Slide coating）
(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗
(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟
(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干

2样品固定（Sample fixation）
(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜
(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS
(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)
(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。

3 脱水（Dehydration）
(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，
(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟
(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟
(4) 在空气中晾干

4 杂交（Hybridization）
(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖
(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）
(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时
(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用

5冲洗
(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer
(2) 在48℃恒温箱中放置30min
(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干

6镜检
晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。

Hybridization buffer配制方法：