这里的克隆是指分子克隆（molecular clone) 或基因克隆，跟克隆羊、克隆人不是一回事，想整个克隆人玩玩的同学别往下看了，完全照着做也克隆不出来。

分子克隆是一个常用的、非常成熟的分子生物学实验。环境生物学实验中常用的对某DNA片段进行克隆，构建克隆文库的方法及大致操作流程如下：

1. PCR
PCR结束后尽快用试剂盒纯化PCR产物，然后最好立即进行下一步，最好不要放在-20度冰箱保存，据说经过冰冻后会影响下面连接的效率。

2. 连接(ligation)
载体(Vector)和外源基因DNA在连接酶的作用下，通过磷酸二酯键进行连接，形成重组质粒，这是分子克隆技术的核心步骤。
现在一般都用试剂盒进行连接反应，以TaKaRa pMD 18-T Vector为例，方法如下：
pMD 18-T Vector  1微升
DNA              0.1~0.3pmol
H2O            up to 5微升
混合好上述溶液后加入5微升 Solution I
然后在PCR仪中16℃反应30分钟即可，非常简单

3. 转化(Transformation)
将重组质粒导入大肠杆菌细胞进行扩增，接受质粒的大肠杆菌要预先用物理或化学方法进行处理，这种处理过的细胞称为感受态细胞（competent cell，[感受态细胞制备方法])。这一步操作对于克隆实验的成功也至关重要。方法如下：
(1) 将连接后形成的质粒加入100微升感受态细胞中，冰水上中放置30分钟
(2) 42℃水浴加热45秒，再放入冰水中1分钟
(3) 加入适量(300~900微升) SOC培养基或LB培养基，37℃震荡培养1小时
(4) 在含有X-Gal, IPTG, AMP的平板上涂布，然后放入37℃培养箱培养。个人感觉，培养16小时左右比较合适，AMP平板中AMP的含量为50mg/L, X-Gal, IPTG, 每个平板各涂20微升，菌液涂50～150微升。

4. PCR确认及质粒提取
挑选白色菌落进行菌落PCR，确认插入片段的长度是否正确。如正确，表示克隆成功，接下来便可以用质粒提取试剂盒提取质粒。

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