2. 点击”Run”,会跳出一个对话框，里面有很多参数需要设置。其中的Size Standard一定要与T-RFLP实验时所使用的Size Standard一致，其它参数可以根据情况适当调整。官方网站上给出了下面一些参数设置建议：

Suggested Analysis Parameters
I. Template Selection
1. Panel: None
2. Analysis Type: AFLP
II. Data Process
1. Raw Data Analysis: select Smooth
2. Allele Call: deselect Auto Range and set start to 60, end to 500
3. Peak Detection Threshold: Intensity > 40
4. Stutter Peak Filter: deselect or set left and right values to 0
III. Additional settings
1. Peak Score: Reject < 0 check 1< Pass
2. AFLP-Unconfidence at Rightside Score: 1

3. 运行完毕之后就打开了GeneMarker分析窗口，可以看到样品的Gel image和electropherogram，点击左侧的样品名称可以逐个查看样品的electropherogram，通过上方的工具条可以进行放大、缩小，查看列表等一系列操作。

4. 保存数据。首先设定Report Settings，其中Report style选择Bin Table (AFLP/MLPA), Option里面可以选择Show intensity或Show Peak Area，我一般使用Show Peak Area。然后点击旁边的Save Report即可保存为excel格式文件。

5. 后续处理。 首先归一化处理（以峰面积之和中等大小的样品为基准），然后去除样品一些小的峰，多小算小？这个要根据实际情况自己设定一个值，然后合并小于1bp的相邻的峰。最后计算每个峰所占的百分比。

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偶然一次发现，原来可以用Word编辑，方法如下：
1. 将MEGA做好的进化树复制到Word中；
2. 右键点击图片，选择” Edit Picture”；
3. OK了，可以使用任何字体、任何颜色编辑进化树了。

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1. 将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：所有序列的方向都要保持一致 ( 5’-3’)。

2. 打开MEGA软件，选择”Alignment” – “Alignment Explorer/CLUSTAL”，在对话框中选择Retrieve sequences from a file, 然后点OK，找到准备好的序列文件并打开。

3. 在打开的窗口中选择”Alignment”-“Align by ClustalX” 进行对齐，对齐过程需要一段时间，对齐完成后，最好将序列两端切齐，选择两端不齐的部分，单击右键，选择delete即可。

4. 关闭当前窗口，关闭的时候会提示两次否保存，第一次无所谓，保存不保存都可以，第二次一定要保存，保存的文件格式是.meg。根据提示输入Title，然后会出现一个对话框询问是否是Protein-coding nucleotide sequence data, 根据情况选择Yes或No。最后出现一个对话框询问是否打开，选择Yes。

5. 回到MEGA主窗口，在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” -“Neighbor-joining”，打开一个窗口，里面有很多参数可以设置，如何设置这些参数请参考详细的MEGA说明书，不会设置就暂且使用默认值，不要修改，点击下面的Compute按钮，系统进化树就画出来了。

6. 最后，使用TreeExplorer窗口中提供的一些功能可以对生成的系统进化树进行调整和美化。另外，还可以用Word进一步编辑MEGA构建的进化树。

一般说来，MEGA适用于对少量的序列进行比对和画Tree，如需处理大量或海量的序列数据，建议使用ARB。

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有下面这么一张DGGE图像，需要分析一下左边第5条泳道的8个条带对应的DNA在样品中占的百分比各分别是多少。

第一步：建立泳道

点击菜单栏“Lane-Auto Frame Lanes”，一般情况下Quantity One会自动识别并建立泳道。但也有很多时候不能自动建立泳道，这就需要选择菜单栏“Lane- Frame Lanes…”然后输入要建立泳道的数目，手动建立泳道。泳道建立后需要调整，在菜单栏“Lane-Edit Frame”中有拉伸、旋转、移动、添加/删除锚点等选项，通过这些选项可以对泳道进行调整，调整后大致如下：

第二步：消除泳道背景

点击菜单栏“Lane-Lane Background…”跳出一个对话框，“All Lanes”中选择第二个，然后点一下第5条泳道，“Selected Lane”的下面会显示Selected Lan:#5(#5)，然后选择”Lane On“ Rolling Disk Size中填一个10～20之间的数(可以多尝试几个，看看效果)，最后点“Done”完成操作。

第三步：建立条带

点击菜单栏“Band->Detect Bands…”打开一个对话框，调整Sensitivity和Lane Width的数值，使每个条带都被检测到，如果条带上面显示的是一条红线，可以在“Band-Band Attributes”的Style栏中选择Brackets，使之显示为括号形式。条带建立后图像显示如下：

第四步：生成报告

点击菜单栏“Report-Lane Report”然后点一下第五条泳道，在弹出的对话框的Measurements 一栏中选择Trace Qty (个人感觉选择这个比较合适，也可以选择其他的看看效果)，然后点Report，就看到了每个条带的Trace Qty值，这个值与DNA的浓度呈正比，根据这个值计算百分比即可。

以上仅仅是Quantity One进行定量的简单流程，非常不具体，一些具体的参数设置及软件的其它功能请参考相关的使用说明或教程。另外，不确定上面的操作是否有不当之处，如有请多指教。

需要特别说明的一点是：对于一个从复杂的环境样品中提取的DNA，经过PCR-DGGE，然后用Quantity One定量，通过分析每条条带的intensity来计算百分比，然后估计原始样品中各个物种（比如细菌）的百分比，这样的做法是非常不准确的，这种数据发paper可能不会被接受，因为整个过程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在类似问题。

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1、线性规划

2、非线性规划

3、线性回归，多元线性回归可以用Origin求解，也可以用Excel的linest函数或分析工具求解。

4、非线性回归

5、求函数在某区间内的极值

注意：Solver插件可以用于解决上面这些问题，并不是说上面这些问题Solver一定可以解决，而且有时候Solver给出的结果也不一定是最优的。

Solver安装方法：

Solver是Excel自带的插件，不需要单独下载安装。但Excel默认是不启用Solver的，启用方法：在”工具”菜单中点击“插件”，在Solver Add-In前面的方框中打勾，然后点OK，Excel会自动加载Solver，一旦启用成功，以后Sovler就会在”工具”菜单中显示。

Solver求解非线性回归问题的方法：

假设X和Y满足这样一个关系：Y=L(1-10^-KX)，实验测得一组X和Y的值如下：

求L和K的值。

在Excel中随便假设一组L和K的值，比如都假设为1，以这组假设的值，求出一组Y’，然后再求出一组(X-Y)²的值，再将求出的这组(X-Y)²的值用Sum函数全部加起来(下面的图中，全部加起来结果在$G$22这个单元格中)。

然后点击“工具”菜单中的Solver，将Set Target Cell设为$G$22这个单元格，将By Changing Cells设为$F$8:$F9这两个单元格，即改变L和K的值，Equal To选中Min这项，其他的选项不用理会，如下图：

然后点右上角的Solver，$F$8:$F9就会改变，改变之后的值即为优化的L和K值。

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下面是5个不错的Origin教程，前三个是英文的，后两个是中文的：

（1）官方网站提供的教程：
http://www.originlab.com/index.aspx?go=Support/DocumentationAndHelpCenter
可以按主题阅读，可以进行相关搜索。

（2）官方网站提供的PDF版本的使用手册：
http://cloud.originlab.com/pdfs/Origin85_Documentation/Getting_Started_Booklet.pdf应该算是最经典，最权威的教程。

（3）在线视频教程：
http://www.originlab.com/index.aspx?go=Support/VideoTutorials
发音清晰，讲解详细，很不错，这些视频教程是flash文件，可以在浏览器红直接看，如果想下载下来，可以查看源文件，找到下面这行源代码：
<param name=movie value=”http://www.originlab.com/ftp/mm_tutorials/***.swf”>
（其中***是相应的文件名）
将http://www.originlab.com/ftp/mm_tutorials/***.swf复制到迅雷中就可以下载下来了。

（4）Origin中文说明：
http://ishare.iask.sina.com.cn/cgi-bin/fileid.cgi?fileid=2651027
比较简单，比较条理，可以作为origin的入门教程。

（5）origin在化学中的应用：
http://ishare.iask.sina.com.cn/cgi-bin/fileid.cgi?fileid=2650960
是一些发表的论文，涉及origin比较高级的应用。

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