做饭和做PCR，仔细琢磨琢磨简直是一样一样的：

1. 步骤很一致。 做饭的时候，穿上围裙，走进厨房，打开冰箱，拿出各种料，解冻……
做PCR的时候，穿上白大褂，走进PCR房间，打开冰箱，拿出各种料，解冻……
看，多么一致的操作步骤啊！

2. 都要用锅。做饭要用锅这个大家都知道；有人纳闷了，做PCR也要用锅吗？是的，没错，最早的PCR就是用锅做的，三个水浴锅，折腾来折腾去，没见过这种锅的人可以到这里(Figure 1b)见识一下，现在用的PCR仪只是个升级版的锅而已。

3. 都讲究火候。做饭最讲究火候了，火候小了不熟，火候大了就糊了；做PCR也是，anealing那一步的火候可重要的，火候小了非特异性扩增，火候大了，啥也扩不出来。

4. 配料都很重要。做饭的时候，油盐酱醋少一样也调不出想要的味道；做PCR的时候Buffer，酶，dNTP，引物，模板一个也不能少。

5. 有时候都要回锅。Nested PCR都知道吧，把第一锅的PCR产物作为模板放进第二锅再次做PCR；做饭有时候也需要这样，吃过烩饼么？第一步先把饼烙熟，切成条状，第二步放进美味的汤里煮像煮面条那样煮一下。类似的还有回锅肉。哈哈

6. 有PCR歌，也有做饭歌。

不了解PCR的同学阅读以上内容可能有困难，那么需要先做点热身运动：看看这个视频，了解一下PCR原理，再看看这个视频，了解一下操作步骤，然后再看就懂啦！

高通量测序（High Throughput Sequencing）又称下一代测序（Next Generation Sequencing），也叫做深度测序（Deep Sequencing），最早由454公司开创，标志性事件是，2005年底454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序（Pyrosequencing）的高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System，后来454公司被Roche以1.55亿美元收购。高通量测序一般一次可以读取上百万甚至几百万条序列，数据量非常大。这种测序的用途很多，随便搜一下就可以找到很多相关资料，前面写的454测序也介绍了一点。个人觉得它的突出优点就是快速取得海量数据，可以摆脱存在Bias的PCR，既可以定性又可以定量。如果价格能够降低一些（现在运行一次要几万到十几万RMB，有点贵！），应该可以替代甚至淘汰很多操作麻烦的分子生物学方法。

高通量测序仪主要有来自三家公司：罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX, FLX Titanium), Illumina公司的Illumina Genome Analyzer,HiSeq 2000和ABI的SOLiD测序仪(SOLiD system).

在网上看到华大基因仅Illumina HiSeq 2000和AB SOLiD 4.0 System这两种高通量测序仪到年底就会有超过150台，真多啊！

由于高通量测序的数据量非常大，后续分析工作就比较复杂，目前好像还没有非常成熟的软件能够完美处理高通量测序的结果。下面是两个用于高通量测序结果分析的工具:

1.RDP Pyrosequencing Pipeline （一个在线平台）
2.微软的Sequence Assembler （一个软件）

如果没做过高通量测序，而想先看看结果是什么样子的，可以从下面的页面下载高通量测序示例结果，包括Roche/454，Illumina/Solexa，ABI/SOLiD三种机型的数据：
http://www.clcbio.com/index.php?id=1290

下面是环境生物技术领域常用的一些分子生物学实验操作流程及数据处理的方法，这些实验的大致作用就是弄清楚一个样品中有些什么微生物，总共有多少种，每种的含量是多少。

0. PCR， 这个步骤就不需要写了，听听PCR之歌吧

1. PCR-DGGE操作步骤

2. 用Quantity One进行定量分析的方法

3. T-RFLP操作步骤

4. 使用GeneMarker分析T-RFLP数据

5. 克隆的方法及操作步骤

6. 感受态细胞制备方法

7. 荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

大约2年多以前，Biorad（伯乐）公司为了宣传推广其新产品，创作了下面这个PCR之歌。听了好几遍，每次都觉得蛮有意思的。PCR (polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应），是一种特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，这项技术的发明对生物学的发展具有划时代的意义。想了解等多有关PCR的知识，可以查看聚合酶链式反应(百度百科，中文）或Polymerase chain reaction（维基百科，英文）
不多说了，看视频，听歌！
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T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) 和DGGE类似，也是一种可以用于分析微生物群落结构的DNA Fingerprinting方法。与DGGE相比它重复性更好，定量更准确，实验流程也比DGGE的操作步骤简单很多，而且不像DGGE那样，要进行很多次反复的优化才能得到比较好的结果。但是T-RFLP的成本要比DGGE高一些，主要因为T-RFLP最后一步要用测序仪完成。下面是T-RFLP的简要操作流程：
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变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。DGGE实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经天天捣鼓PCR-DGGE，反复优化各个条件，非常无聊。
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荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。非生物学专业的同学请不要往下看了。
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昨天和师兄一起去港大的Genome Research Center了解了一下关于454测序的情况，那边的老师很耐心地给我们作了相关介绍。今天把了解到的内容简单整理一下：

1. 454测序原理
简单说就是把DNA样品中的每条DNA连到一个小球上，然后通过一系列的反应和操作，可以得到从小球开始的大约400个bp的序列。一个454测序反应理论上可以得到100万条序列，考虑到效率的问题，实际得到的序列可能略少一些。
具体说来非常复杂，就不说了。

2. 454测序可以用来干什么？
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最近一直在忙活PCR-DGGE，总是做不出非常完美的结果，深深地陷进去了，一个师姐竟然都称呼我“PCR师弟”了，汗啊！好久没在博客上写东西了，在网站统计中看到有的同学经常每隔几天就到我的博客上来看看，也不知道这些同学每次来都看不到新鲜玩意是不是有点失望，呵呵。接下来的较长一段时间内，应该还是不会经常在博客上写东西（主要是没时间，时间一点也不像海绵里的水那么容易挤出来），所以可以不那么频繁的过来看，以免产生永久失望:)

噢，对了，不知道什么是PCR-DGGE的同学可以看这里和这里（中文的），这里和这里（英文的），不过不要看得太仔细了，以免引起头部不适。